Biocatalytic transamination with recombinant Saccharomyces cerevisiae: Challenges and opportunities

Författare

Nora Weber

Summary, in Swedish

Popular Abstract in Swedish

Den här avhandlingen handlar om att skräddarsy mikroorganismer så att de kan utföra specifika kemiska reaktioner. Nästan alla material och produkter vi har omkring oss idag har framställts genom kemiska metoder. Ofta används olja vilken så småningom kommer sina, som utgångskemikalie. När de framställda produkterna sedan förbränns efter användning släpps koldioxid ut vilket leder till klimatförändringar. Ett långsiktigt mål med att använda mikroorganismer för att utföra kemiska reaktioner är därför att kunna ersätta oljan med förnyelsebara råvaror.

Framställningen av kemiska produkter sker oftast med hjälp av katalysatorer vilka definieras av att de höjer hastigheten på kemiska reaktioner utan att själva förbrukas. Katalysatorerna kan till exempel vara organiska molekyler som framställs genom komplicerade processer, eller metaller som kan vara både giftiga och förorena produkten. Biokatalys använder istället enzymer, vilka är biologiska katalysatorer gjorda av protein eller hela celler (vilka innehåller enzymer). Därför är biokatalysatorerna biologiskt nerbrytningsbara samt både billiga och enkla att producera, eftersom man kan odla dem i sockerlösningar eller t.o.m. på avfall från livsmedelsindustrin.

När man har en molekyl kan de kemiska grupperna (delarna), till exempel en amingrupp, peka i olika riktningar. Dessa olika former av molekylen kan ha helt olika effekter eller bi-verkningar i kroppen och om så är fallet får läkemedel bara innehålla den ena formen. Biokatalysatorer är väldigt selektiva och omvandlar bara en av formerna vilket är en mycket användbar egenskap vid läkemedelstillverkning. Dessutom kan de ibland framställa kemiska byggstenar eller hela läkemedel i ett enda processteg, medan kemiska processer kräver många processteg. Processer med biokatalysatorer är även användar- och miljövänliga p.g.a. att man kan använda vatten som lösningsmedel istället för andra giftiga lösningsmedel.

I mitt arbete har jag använt hela jästceller som biokatalysatorer. Dessa har ett flertal fördelar jämfört med att utnyttja enzymer som upprenats från celler. Hela celler är t.ex. mycket billigare att producera än upprenade enzymer eftersom man slipper hela uppreningsprocessen. Speciellt reaktioner som kräver flera steg och många enzymer är bra att utföra i hela celler eftersom alla enzymer kan produceras direkt i cellen. Vidare kan man utnyttja cellens egen metabolism för att producera ämnen cellen behöver använda som bi-ämne i reaktionen, för att framställa kemiska byggstenar eller läkemedel. Nackdelar med hela celler är dock att problematiska bi-produkter kan bildas och att transporten av utgångskemikalie och produkt till och från cellen kan vara begränsande. Slutligen kan både utgångskemikalien och produkten vara giftiga för cellerna.

Inom avhandlingsarbetet har jag studerat två olika sorters reaktioner, (I) transamination där en amingrupp flyttas från en molekyl till en annan och skapar en ketongrupp där amingruppen tidigare var; och (II) reduktion där till exempel en ketongrupp reduceras till en alkoholgrupp. Båda dessa reaktioner är viktiga vid framställning av flera olika läkemedel som till exempel används vid behandling av Alzheimer’s, diabetes eller HIV. För att kunna utföra dessa reaktioner genmodifierade jag flera olika jäststammar och visade att dessa kan användas för att framställa byggstenar för läkemedel. Specifikt såg jag att man kan använda genmodifierad bagerijäst för transamination vilket inte var känt sedan tidigare. Jag visar även att man kan låta cellerna metabolisera socker för att framställa bi-ämnen som behövs både i transaminations- och reduktionsreaktionen. På så sätt har mitt arbete bidragit till en ökad kunskap om hur biokatalys med hela celler kan användas.

Artikelsammanfattning

I artikel I rapporterar jag om ett transaminas (enzymet som utför transamination) från chilipeppar, och visar att det är aktivt vid det pH (surhet) som råder inuti celler. Detta gjorde jag genom att göra en transaminationsreaktion med enzymet vid olika pH. Jag upptäckte även att transaminaset från chilipeppar är mycket selektivt och endast omvandlar amingrupper som pekar i en riktning. Transaminaset är således lämpligt att användas inom biokatalys med hela celler.

I artikel II visar jag en jämförelse av genmodifierad bagerijäst och genmodifierade bakterier som innehöll samma transaminas. Resultatet av studien var att jästen kunde omvandla mer av utgångskemikalien. Jag visade även att socker kunde användas som bi-ämne och omvandlas till pyruvat i cellen, vilket är den molekyl som tar emot amingruppen i reaktionen. Socker är mycket billigare att tillsätta än pyruvat, vilket brukar användas som bi-ämne till transamination med upprenade enzymer. Dessutom levde jästcellerna fortfarande efter att ha utfört reaktionen tre gånger så lång tid när socker användes, jämfört med pyruvat. Detta skulle därför möjliggöra en längre process.

I artikel III beskriver jag möjligheten att koppla en reduktionsreaktion till transaminationen. Den första reaktionen är en transamination där det bildas en keton som sen omvandlades till en alkohol i andra steget, med hjälp av ett enzym som heter reduktas. På så sätt kunde jag få jästen att utföra två kemiska reaktioner i ett enda processteg. Transaminationen blev ännu effektivare när cellen innehöll både transaminas och reduktas jämfört med bara transaminas. Detta beror på att ketonen har en inhiberande effekt på transaminationen men när reduktaset eliminerar ketonen, försvinner den effekten.

I artikel IV visar jag en jämförelse av tre olika transaminaser som introducerats i bagerijäst, för att undersöka vilket som ger effektivast reaktion. Två av enzymerna kom från olika bakterier och jämfördes med det från chilipeppar. Transaminaset från den ena av bakterierna var bäst för den visade snabbast reaktion i hela celler. Jag genmodifierade även en jäststam så den innehöll mer av transaminaset från bakterien. Den nya jäststammen omvandlade allt av utgångskemikalien medan omvandlingen i de hittills beskrivna experimenten låg omkring 50%. Till slut visade jag att transaminationen blir effektivare om man inte tillsätter vitamin B1 i växtmediet p.g.a. att jästcellerna då själva bildar mer vitamin B6, vilket behövs för transaminationsreaktionen.

Avdelning/ar