Advances and Applications of Antibody Arrays - Proteomic Profiling of Pancreatic Disease
Författare
Summary, in Swedish
Popular Abstract in Swedish
Antikroppar är proteiner som ingår i kroppens immunförsvar, där de fungerar som bindare för att neutralisera patogena mikroorganismer eller ämnen som infekterat kroppen. Vid en infektion börjar immunceller producera antikroppar genom att på ett smart sätt sätta ihop olika gener. Varje enskild immuncell använder en viss kombination av gener och producerar därmed antikroppar som har en särskild specificitet. Antikroppsgenerna kan kombineras på ett nästan oändligt antal olika sätt, vilket innebär att kroppens immunceller kan generera bindare mot i princip vilken molekyl som helst. Antikropparnas förmåga att binda starkt och specifikt till olika molekyler är unik, och kan med fördel utnyttjas i olika tekniska applikationer. Ett exempel på en sådan teknik är antikroppschip, antibody microarrays, och allt arbete i den här avhandlingen kretsar kring den tekniken. Min forskning har syftat både till att använda antikroppschip inom sjukdomsdiagnostik, med fokus på sjukdomar i bukspottskörteln (artikel I-III), men även att på olika sätt vidareutveckla tekniken (artikel IV och V).
De antikroppschip som under det senaste decenniet har utvecklats av vår forskningsgrupp, tillverkas genom att syntetiska antikroppar sätts ned av en robot i mycket små volymer, 3•10-9 l, som små prickar med en diameter av ca 0.1 mm, i ett förutbestämt matrismönster, en så kallad array, på en chipyta. Varje array innehåller hundratals olika antikroppar, och varje chip kan innehålla flera likadana sådana arrayer. Antikropparna har på förhand tagits fram från så kallade antikroppsbibliotek, som har skapats genom att på syntetisk väg härma immuncellernas förmåga att kombinera olika gener. Antikroppsbiblioteken innehåller flera miljarder unika antikroppar som till stor del ser likadana ut, de är baserade på samma stomme, men de skiljer sig åt i de aminosyror som används för att binda andra molekyler. Ur antikroppsbiblioteket kan man plocka fram antikroppar som binder specifikt till de molekyler man vill undersöka. Antikropparna produceras därefter i bakterier, och renas upp, innan de sätts på chip.
Antikroppschipen används för att analysera kliniska prover, vilka i mitt fall har varit uteslutande blodprover, även om tekniken även fungerar för andra provformat, såsom urin, celler eller vävnad. Varje patientprov analyseras på en enskild array, vars antikroppar fångar de proteiner i provet som de är specifika för. Proteinerna i patientproverna har på förhand märkts in med en fluorescerande molekyl, ett system som gör att man kan mäta den relativa mängden protein som bundit till varje antikroppsprick genom att läsa in chipet i en laserscanner. På så sätt kan man för varje patient skapa en unik proteinprofil. Undersöker man hela grupper av patienter med en viss sjukdom, och jämför deras profiler mot exempelvis friska individer, kan man identifiera proteinsignaturer, kombinationer av proteiner som har förändrade blodnivåer i den sjuka gruppen jämfört med kontrollgruppen. Proteinsignaturerna kan då fungera som markörer, likt fingeravtryck, för den specifika sjukdomen. När sådana biomarkörer har identifierats måste de först valideras i andra, oberoende prover, innan de kan användas kliniskt för att exempelvis detektera, diagnosticera eller prognosticera sjukdomen.
En sjukdom där det finns ett stort behov av biomarkörer är cancer i bukspottskörteln, pankreas. Pankreascancer är en mycket aggressiv form av cancer, och trots att den inte är så vanlig (den drabbar ca 900 svenskar per år), är det den sjätte vanligaste cancerrelaterade dödsorsaken, och endast ca 6% av patienterna överlever 5 år efter diagnos. Anledningen till att så många dör av pankreascancer är att sjukdomen oftast upptäcks i ett alltför sent skede, när tumören har vuxit sig så stor, och ofta även bildat metastaser, att den inte går att operera bort. Den sena detektionen beror dels på att symptomen är vaga och lätt kan förväxlas med andra sjukdomar, dels på att det saknas biomarkörer för tidig diagnos av pankreascancer.
Pankreatit, eller inflammation i bukspottskörteln, är just en sådan sjukdom som pankreascancer lätt kan förväxlas med. Därför är det viktigt att biomarkörer för pankreascancer inte bara kan särskilja cancerpatienter från friska individer, utan även från patienter med pankreatit. I artikel I och II har vi identifierat sådana proteinsignaturer, vilka potentiellt kan fungera som specifika biomarkörer för pankreascancer. Även för pankreatit, som kan vara både av det akuta, kroniska, eller autoimmuna slaget, saknas det känsliga och specifika biomarkörer. I artikel III använde vi våra antikroppschip för att ta fram proteinprofiler för de olika formerna av pankreatit genom att jämföra olika provgrupper mot varandra, men också mot friska individer. De här signaturerna kan dels utgöra potentiella biomarkörer för diagnos av pankreatit, men kan också ge insikt i de molekylära processer som är involverade i de olika typerna av pankreatit.
Parallellt med att jag och andra har utfört kliniska studier med hjälp av våra antikroppschip, har tekniken fortsatt att utvecklas. Jag har varit involverad i flera sådana utvecklingsprojekt, varav två har resulterat i publikationer som presenteras i den här avhandlingen. I artikel IV analyserade vi bland annat chip producerade på olika ytor för att utvärdera vilken yta som lämpade sig bäst för våra antikroppar. Det visade sig att en polymeryta, till vilken antikropparna binder genom enkel adsorption, gav de bästa resultaten, i form av hög reproducerbarhet (låg mätvariation), känslighet (låg detektionsgräns), och dynamisk range (stort mätområde). Vi visade även att vi kunde tillverka antikroppsarrayer i botten på brunnar i en 96-hålsplatta, något som kan underlätta teknikens användarvänlighet i en eventuell framtida klinisk implementering.
I artikel V undersökte vi möjligheten att expandera arraytekniken för att utöver proteiner även analysera glykosylerings- och karbonyleringsmönster. Glykosylering och karbonylering är exempel på post-translationell modifiering, PTM, av proteiner. PTM är en naturlig process som innebär att proteiner modifieras på olika sätt efter det att deras grundstruktur har skapats, det vill säga efter det att aminosyror har satts ihop till proteiner enligt den genbaserade koden som finns i vårt DNA. Glykosylering innebär att kolhydratstrukturer kopplas på proteinet, och karbonylering är en form av oxidering av proteinerna. PTM är viktig exempelvis för proteinstabilitet eller signalering, men det har även visat sig att modifieringarna kan påverkas i sjukdomstillstånd. På så sätt kan förändrade nivåer eller mönster av PTM fungera som markörer för sjukdomar, och kan komplettera traditionella biomarkörer baserade på förändringar av proteinnivåer. Genom att introducera en ny typ av reagens till vår analys visade vi att vi kunde mäta både nivåer av glykosylering och karbonylering för olika proteiner på våra antikroppschip. När vi hade visat att tekniken fungerade gjorde vi en första studie på preeklampsi, eller havandeskapsförgiftning, och kunde då identifiera både glykosylerings- och karbonyleringssignaturer som kunde särskilja patienter med preeklampsi från friska gravida kvinnor.
Sammanfattningsvis handlar den här avhandlingen om tillämpning och utveckling av en antikroppsbaserad microarrayteknik. Dels har min forskning syftat till att optimera och vidareutveckla tekniken, men främst till att applicera analysmetoden för att leta biomarkörer, med särskilt fokus på pankreascancer och pankreatit. Förhoppningsvis kan mina resultat och fortsatta studier i förlängningen leda till att nya biomarkörer för bättre och tidigare diagnos kan introduceras till sjukvården.
Antikroppar är proteiner som ingår i kroppens immunförsvar, där de fungerar som bindare för att neutralisera patogena mikroorganismer eller ämnen som infekterat kroppen. Vid en infektion börjar immunceller producera antikroppar genom att på ett smart sätt sätta ihop olika gener. Varje enskild immuncell använder en viss kombination av gener och producerar därmed antikroppar som har en särskild specificitet. Antikroppsgenerna kan kombineras på ett nästan oändligt antal olika sätt, vilket innebär att kroppens immunceller kan generera bindare mot i princip vilken molekyl som helst. Antikropparnas förmåga att binda starkt och specifikt till olika molekyler är unik, och kan med fördel utnyttjas i olika tekniska applikationer. Ett exempel på en sådan teknik är antikroppschip, antibody microarrays, och allt arbete i den här avhandlingen kretsar kring den tekniken. Min forskning har syftat både till att använda antikroppschip inom sjukdomsdiagnostik, med fokus på sjukdomar i bukspottskörteln (artikel I-III), men även att på olika sätt vidareutveckla tekniken (artikel IV och V).
De antikroppschip som under det senaste decenniet har utvecklats av vår forskningsgrupp, tillverkas genom att syntetiska antikroppar sätts ned av en robot i mycket små volymer, 3•10-9 l, som små prickar med en diameter av ca 0.1 mm, i ett förutbestämt matrismönster, en så kallad array, på en chipyta. Varje array innehåller hundratals olika antikroppar, och varje chip kan innehålla flera likadana sådana arrayer. Antikropparna har på förhand tagits fram från så kallade antikroppsbibliotek, som har skapats genom att på syntetisk väg härma immuncellernas förmåga att kombinera olika gener. Antikroppsbiblioteken innehåller flera miljarder unika antikroppar som till stor del ser likadana ut, de är baserade på samma stomme, men de skiljer sig åt i de aminosyror som används för att binda andra molekyler. Ur antikroppsbiblioteket kan man plocka fram antikroppar som binder specifikt till de molekyler man vill undersöka. Antikropparna produceras därefter i bakterier, och renas upp, innan de sätts på chip.
Antikroppschipen används för att analysera kliniska prover, vilka i mitt fall har varit uteslutande blodprover, även om tekniken även fungerar för andra provformat, såsom urin, celler eller vävnad. Varje patientprov analyseras på en enskild array, vars antikroppar fångar de proteiner i provet som de är specifika för. Proteinerna i patientproverna har på förhand märkts in med en fluorescerande molekyl, ett system som gör att man kan mäta den relativa mängden protein som bundit till varje antikroppsprick genom att läsa in chipet i en laserscanner. På så sätt kan man för varje patient skapa en unik proteinprofil. Undersöker man hela grupper av patienter med en viss sjukdom, och jämför deras profiler mot exempelvis friska individer, kan man identifiera proteinsignaturer, kombinationer av proteiner som har förändrade blodnivåer i den sjuka gruppen jämfört med kontrollgruppen. Proteinsignaturerna kan då fungera som markörer, likt fingeravtryck, för den specifika sjukdomen. När sådana biomarkörer har identifierats måste de först valideras i andra, oberoende prover, innan de kan användas kliniskt för att exempelvis detektera, diagnosticera eller prognosticera sjukdomen.
En sjukdom där det finns ett stort behov av biomarkörer är cancer i bukspottskörteln, pankreas. Pankreascancer är en mycket aggressiv form av cancer, och trots att den inte är så vanlig (den drabbar ca 900 svenskar per år), är det den sjätte vanligaste cancerrelaterade dödsorsaken, och endast ca 6% av patienterna överlever 5 år efter diagnos. Anledningen till att så många dör av pankreascancer är att sjukdomen oftast upptäcks i ett alltför sent skede, när tumören har vuxit sig så stor, och ofta även bildat metastaser, att den inte går att operera bort. Den sena detektionen beror dels på att symptomen är vaga och lätt kan förväxlas med andra sjukdomar, dels på att det saknas biomarkörer för tidig diagnos av pankreascancer.
Pankreatit, eller inflammation i bukspottskörteln, är just en sådan sjukdom som pankreascancer lätt kan förväxlas med. Därför är det viktigt att biomarkörer för pankreascancer inte bara kan särskilja cancerpatienter från friska individer, utan även från patienter med pankreatit. I artikel I och II har vi identifierat sådana proteinsignaturer, vilka potentiellt kan fungera som specifika biomarkörer för pankreascancer. Även för pankreatit, som kan vara både av det akuta, kroniska, eller autoimmuna slaget, saknas det känsliga och specifika biomarkörer. I artikel III använde vi våra antikroppschip för att ta fram proteinprofiler för de olika formerna av pankreatit genom att jämföra olika provgrupper mot varandra, men också mot friska individer. De här signaturerna kan dels utgöra potentiella biomarkörer för diagnos av pankreatit, men kan också ge insikt i de molekylära processer som är involverade i de olika typerna av pankreatit.
Parallellt med att jag och andra har utfört kliniska studier med hjälp av våra antikroppschip, har tekniken fortsatt att utvecklas. Jag har varit involverad i flera sådana utvecklingsprojekt, varav två har resulterat i publikationer som presenteras i den här avhandlingen. I artikel IV analyserade vi bland annat chip producerade på olika ytor för att utvärdera vilken yta som lämpade sig bäst för våra antikroppar. Det visade sig att en polymeryta, till vilken antikropparna binder genom enkel adsorption, gav de bästa resultaten, i form av hög reproducerbarhet (låg mätvariation), känslighet (låg detektionsgräns), och dynamisk range (stort mätområde). Vi visade även att vi kunde tillverka antikroppsarrayer i botten på brunnar i en 96-hålsplatta, något som kan underlätta teknikens användarvänlighet i en eventuell framtida klinisk implementering.
I artikel V undersökte vi möjligheten att expandera arraytekniken för att utöver proteiner även analysera glykosylerings- och karbonyleringsmönster. Glykosylering och karbonylering är exempel på post-translationell modifiering, PTM, av proteiner. PTM är en naturlig process som innebär att proteiner modifieras på olika sätt efter det att deras grundstruktur har skapats, det vill säga efter det att aminosyror har satts ihop till proteiner enligt den genbaserade koden som finns i vårt DNA. Glykosylering innebär att kolhydratstrukturer kopplas på proteinet, och karbonylering är en form av oxidering av proteinerna. PTM är viktig exempelvis för proteinstabilitet eller signalering, men det har även visat sig att modifieringarna kan påverkas i sjukdomstillstånd. På så sätt kan förändrade nivåer eller mönster av PTM fungera som markörer för sjukdomar, och kan komplettera traditionella biomarkörer baserade på förändringar av proteinnivåer. Genom att introducera en ny typ av reagens till vår analys visade vi att vi kunde mäta både nivåer av glykosylering och karbonylering för olika proteiner på våra antikroppschip. När vi hade visat att tekniken fungerade gjorde vi en första studie på preeklampsi, eller havandeskapsförgiftning, och kunde då identifiera både glykosylerings- och karbonyleringssignaturer som kunde särskilja patienter med preeklampsi från friska gravida kvinnor.
Sammanfattningsvis handlar den här avhandlingen om tillämpning och utveckling av en antikroppsbaserad microarrayteknik. Dels har min forskning syftat till att optimera och vidareutveckla tekniken, men främst till att applicera analysmetoden för att leta biomarkörer, med särskilt fokus på pankreascancer och pankreatit. Förhoppningsvis kan mina resultat och fortsatta studier i förlängningen leda till att nya biomarkörer för bättre och tidigare diagnos kan introduceras till sjukvården.
Avdelning/ar
- Institutionen för immunteknologi
- BioCARE: Biomarkers in Cancer Medicine improving Health Care, Education and Innovation
Publiceringsår
2013
Språk
Engelska
Fulltext
- Available as PDF - 12 MB
- Available as PDF - 720 kB
- Available as PDF - 916 kB
- Download statistics
Dokumenttyp
Doktorsavhandling
Ämne
- Immunology in the medical area
Nyckelord
- Proteomics
- affinity proteomics
- antibody microarray
- pancreatic cancer
- pancreatitis
- biomarker
- immunosignature
Status
Published
Handledare
- Christer Wingren
ISBN/ISSN/Övrigt
- ISBN: 978-91-7473-748-6
Försvarsdatum
6 december 2013
Försvarstid
09:15
Försvarsplats
Hörsalen, Medicon Village, Scheelevägen 2, Lund University, Faculty of Engineering
Opponent
- Marta Sanchez-Carbayo (Prof.)